針對(duì)抗性基因與基因轉(zhuǎn)移元件的相關(guān)性，sulI與intI1具有極顯著的相關(guān)性(p<0.001;r=0.803)，這可能由于sulI經(jīng)常與一類整合子結(jié)合在一起指出tetM可能由轉(zhuǎn)座子Tn916Tn1545和結(jié)合質(zhì)粒介導(dǎo).

　　3 畜禽養(yǎng)殖廢水中重金屬對(duì)抗生素抗性基因的影響 

　　畜禽養(yǎng)殖過程在飼料中添加銅、鋅等重金屬引起豬糞水中抗銅、抗鋅細(xì)菌的增加，畜禽養(yǎng)殖廢水存在抗生素與重金屬復(fù)合污染特征.在重金屬的選擇壓力下，畜禽養(yǎng)殖糞水中重金屬抗性基因豐度較高.對(duì)豬飼料、腸道和糞便中抗銅細(xì)菌進(jìn)行了分析鑒定，發(fā)現(xiàn)豬糞中抗銅大腸桿菌與飼料中硫酸銅添加量正相關(guān)，分離得到的239株抗銅細(xì)菌中攜帶抗銅基因pcoA、pcoC、pcoD，攜帶抗銅基因的細(xì)菌也同時(shí)攜帶鏈霉素和四環(huán)素的抗性基因(strA、strB、tetB).而研究了豬糞中抗鋅細(xì)菌的分布規(guī)律，結(jié)果表明豬糞中普遍存在抗鋅細(xì)菌，抗鋅大腸桿菌的檢出率與飼料中氧化鋅的添加成正相關(guān)關(guān)系;抗鋅菌株主要攜帶抗鋅基因zntA.

　　畜禽養(yǎng)殖環(huán)境重金屬的污染不僅引起重金屬耐受菌及抗銅、抗鋅基因豐度的提高，可能存在重金屬與抗生素的協(xié)同選擇作用(coselection)，重金屬的選擇壓力可能使抗生素抗性基因豐度維持在較高水平.歐盟國家已禁止抗生素飼料添加劑的使用，但減少抗生素使用并不會(huì)阻止抗性基因的傳播，養(yǎng)殖場重金屬使用可能會(huì)通過協(xié)同選擇增加抗生素抗性基因的傳播.研究發(fā)現(xiàn)磺胺類sulA與重金屬Hg、Cu、Zn具有顯著相關(guān)關(guān)系.研究發(fā)現(xiàn)豬場廢水中高濃度的Cu和Zn顯著提高了耐β內(nèi)酰胺大腸桿菌的豐度.

 圖1 豬糞分離的具有重金屬與抗生素協(xié)同抗性的質(zhì)粒pMC2

　　指出重金屬和抗生素抗性的協(xié)同選擇機(jī)制主要是因?yàn)橹亟饘俸涂股�素的抗性機(jī)制的耦合作用，包括交叉抗性(crossresistance)和協(xié)同抗性(coresistance).交叉抗性是某種抗性基因編碼的酶或蛋白具有提高細(xì)胞耐受多種抑菌物質(zhì)(如抗生素或重金屬)的能力，如多重藥劑外排泵(multi drug efflux pumps)，其可以將毒性物質(zhì)迅速排出細(xì)胞外.而協(xié)同抗性指的是具有兩種或多種抗性功能的基因相互鄰近并在一個(gè)移動(dòng)基因元件上.如豬糞中分離的質(zhì)粒pMC2，攜帶大環(huán)內(nèi)脂、四環(huán)素等抗生素抗性基因和汞、鉻等重金屬抗性基因，具有很強(qiáng)的移動(dòng)和結(jié)合能力總結(jié)了畜禽糞便中重金屬引起抗生素協(xié)同抗性的最小濃度(Minimum coselective concentration，MCC)，Cu和Zn的MCC值分別為11.79和22.75 mg · kg-1 DM，但作者也指出非常缺乏畜禽養(yǎng)殖廢水重金屬對(duì)抗生素抗性基因協(xié)同選擇的數(shù)據(jù).另外，養(yǎng)殖廢水復(fù)合污染的特性也增加了抗性基因研究的難度.4 畜禽養(yǎng)殖廢水處理工藝對(duì)抗性基因的消減 (Removal of antibiotic resistance genes during process of animal wastewater treatment) 4.1 常規(guī)生物處理工藝

　　厭氧消化是畜禽養(yǎng)殖場采用最為廣泛的廢水處理工藝.指出厭氧過程抑制細(xì)菌代謝，對(duì)抗性基因傳播具有抑制作用.指出ARGs去除與厭氧菌群結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性，主要表現(xiàn)在抗性基因的宿主菌群在厭氧環(huán)境中的變化.

　　針對(duì)厭氧消化處理養(yǎng)殖廢水抗性基因的變化，現(xiàn)場調(diào)研較多，參數(shù)優(yōu)化的研究較少，針對(duì)豬場廢水的研究較多，其他種類的養(yǎng)殖廢水研究較少，不同生物處理工藝抗性基因賦存特征詳見表 2.研究了不同規(guī)模豬場的廢水生物處理系統(tǒng)抗性基因去除效果，結(jié)果表明厭氧消化和好氧生物處理對(duì)tetA、tetW、sul1、sul2、blaTEM抗性基因平均去除率在33.3%~97.56%.考察了環(huán)境溫度下厭氧消化在不同季節(jié)的處理效果，夏季ermB、ermF、ermX的去除效果優(yōu)于冬季，夏季厭氧消化出水較豬場原廢水ermB、ermF、ermX和tetG平均降低1.2、0.8、0.7和1.1 log copies · mL-1，表明溫度是厭氧消化去除抗性基因的重要控制指標(biāo).針對(duì)溫度對(duì)厭氧消化抗性基因消減的影響，)指出高溫厭氧消化對(duì)四環(huán)素類抗性基因tetA、tetO、tetW、tetX有顯著去除，它們的去除符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，而tetL只存在于革蘭氏陰性菌，厭氧處理對(duì)其去除效果不明顯，而在好氧高溫處理(55 ℃)過程中tetL豐度表現(xiàn)出線性降低趨勢.比較了高溫和中溫厭氧消化對(duì)牛糞中耐藥菌的影響，結(jié)果表明高溫可全部消滅多重耐藥菌(抗頭孢唑啉、新霉素、萬古霉素、土霉素、氨芐西林等)，而中溫發(fā)酵只可以去除多重耐藥菌1~2 log cfu · mL-1.

表2 豬場廢水生物處理過程中抗性基因的賦存特性

　　除厭氧消化工藝以外，氧化塘、人工濕地也是畜禽養(yǎng)殖場廣泛使用的廢水處理工藝.Joy等.調(diào)查了氧化塘儲(chǔ)存豬場廢水40 d抗性基因的變化，ermB和ermF的豐度分別降低了50%~60%和80%~90%，而tetX和tetQ豐度的消減符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型.將氧化塘處理豬場廢水后抗性基因的去除趨勢歸為兩類，一類是相對(duì)豐度大幅降低甚至低于檢測限，包括tetB、tetL;另一類為經(jīng)處理后豐度不變甚至有所提高，包括tetG、tetM、tetO和tetX，可能因?yàn)檫@類基因常位于轉(zhuǎn)移原件上，在廢水中發(fā)生了基因的水平轉(zhuǎn)移.鄭加玉等采用水平流人工濕地處理豬場廢水，結(jié)果表明tetW、tetM和tetO的濃度平均去除率分別為95.73%、92.21%和95.05%;可能由于土壤對(duì)抗性基因的吸附作用，濕地土壤中抗性基因的豐度有明顯升高現(xiàn)象.Liu等模擬垂直流人工濕地中添加沸石研究抗性基因的消減規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在HRT為30 h時(shí)豬場廢水抗性基因去除效果較好.

　　4.2 膜生物反應(yīng)器(Membrane bioreactor，MBR)工藝

　　膜分離技術(shù)近年已在畜禽養(yǎng)殖廢水處理領(lǐng)域得到了一定的研究與應(yīng)用，并日益得到重視.例如，Padmasiri等采用厭氧MBR處理豬場廢水，有機(jī)負(fù)荷為1.0 kg · m-3 · d-1高于其他厭氧消化工藝采用好氧MBR處理豬場厭氧消化液TN負(fù)荷0.11 kg · m-3 · d-1較高.然而針對(duì)MBR處理畜禽養(yǎng)殖廢水抗性基因去除規(guī)律的研究較少.Du等調(diào)研了污水處理廠采用A2OMBR工藝處理生活和工業(yè)混合廢水對(duì)四環(huán)素類和磺胺類抗性基因的去除效果，結(jié)果表明MBR工藝對(duì)tetG、tetW、tetX、sul1和intI1分別去除了2.20、2.90、1.71、2.15和2.07 log copies · mL-1，膜出水抗性基因豐度仍然較高(2.85~4.97 log copies · mL-1)，然而作者并未給出膜孔徑等膜分離工藝參數(shù).

　　同常規(guī)生物處理工藝相比，MBR的生物量高，可能存在較大的抗性基因水平轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn).Yang等以RP4質(zhì)粒作為水平轉(zhuǎn)移研究對(duì)象，研究了MBR中抗性基因的水平轉(zhuǎn)移效率，結(jié)果表明RP4在MBR中維持較高豐度104 copies/mg · biosolid，具有較高的水平轉(zhuǎn)移效率(2.76×10-5/recipient)，而RP4在常規(guī)活性污泥法的水平轉(zhuǎn)移效率約4×10-6 /recipient;盡管存在較高的水平轉(zhuǎn)移效率，但由于微濾膜(PVDF，0.22 μm)的截留作用，出水檢測不到攜帶抗性基因的RP4.由于膜的截留，一方面可消減膜出水的抗性基因濃度，另一方面導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)污泥濃度高，可能使抗性基因在反應(yīng)器內(nèi)積累，提高了污泥中抗性基因的水平傳播.污泥是重要的抗性基因蓄積庫，經(jīng)過堆肥或厭氧消化處理后作為肥料土地利用，污泥的土地利用存在抗性基因的污染隱患.

　　4.3 消毒工藝

　　已有研究考察了消毒工藝(包括紫外、臭氧、加氯)處理畜禽養(yǎng)殖廢水時(shí)對(duì)耐藥菌的殺滅效果.研究發(fā)現(xiàn)，加氯量和臭氧用量分別為30 mg · L-1和100 mg · L-1時(shí)，豬場氧化塘廢水中細(xì)菌總數(shù)分別去除了2.2~3.4 log cfu · mL-1和3.3~3.9 log cfu · mL-1，然而林可酰胺、金霉素、磺胺甲惡唑耐藥菌對(duì)加氯消毒不敏感，而四環(huán)素耐藥菌對(duì)加氯消毒敏感，臭氧對(duì)耐藥菌的影響并未給出相應(yīng)結(jié)果.加氯對(duì)抗萬古霉素腸球菌具有較好的滅殺作用.而GomezAlvarez等研究加氯消毒對(duì)飲用水中抗性基因的影響，宏基因組數(shù)據(jù)表明加氯消毒后飲用水中仍含有編碼β內(nèi)酰胺酶(bla)、外排泵等抗生素抗性基因，表明耐受液氯氧化性的細(xì)菌同時(shí)攜帶抗生素抗性基因.關(guān)于紫外和臭氧對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水抗性基因的去除研究較為缺乏,研究了紫外滅菌對(duì)市政排水抗性基因消減的影響，結(jié)果表明紫外強(qiáng)度為249.5 mJ · cm-2時(shí)對(duì)抗性基因消減效果最佳，tetX和16S rRNA分別去除了0.58和0.60 log.Oh等采用模擬實(shí)驗(yàn)研究了臭氧對(duì)耐藥性埃希氏大腸桿菌(Eschericia coli， E. coli)的去除，結(jié)果表明臭氧劑量為3 mg · L-1時(shí)耐藥性E. coli去除了1 log.

　　4.4 組合工藝

　　畜禽養(yǎng)殖廢水通常采用厭氧好氧組合工藝進(jìn)行處理.Chen等在監(jiān)測某豬場夏季廢水處理工藝對(duì)抗性基因去除效果時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過厭氧消化好氧濾池處理，ermB豐度分別降低了1.2 log、0.9 log copies · mL-1，而ermB在出水儲(chǔ)存池中已低于檢測限;tetG在厭氧、好氧過程分別降低了1.1 log、3.4 log copies · mL-1.對(duì)我國東部某豬場廢水采用厭氧消化與氧化塘組合工藝去除抗性基因的效果進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)tetO、tetQ、tetW有明顯去除，豐度從10-1降至10-3 copies/16S rRNA，這可能由于tetQ和tetW宿主細(xì)菌多為厭氧菌，而tetO多為好氧菌攜帶，這些抗性基因無法在厭氧好氧交替環(huán)境中維持.而關(guān)于生物處理與消毒組合工藝對(duì)畜禽廢水中抗性基因的去除作用，研究結(jié)果非常缺乏.

　　5 畜禽養(yǎng)殖廢水農(nóng)田利用對(duì)土壤和植物中抗性基因的影響

　　由于畜禽養(yǎng)殖廢水中富含有機(jī)質(zhì)、氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)，通常經(jīng)過厭氧發(fā)酵、氧化塘等工藝處理后，作為肥水還田利用，這既節(jié)約了處理成本，也促進(jìn)了養(yǎng)分循環(huán)利用，目前我國、美國、歐洲等國家都推行畜禽養(yǎng)殖廢水的農(nóng)田利用.然而，畜禽養(yǎng)殖廢水農(nóng)田利用可能產(chǎn)生抗性基因從養(yǎng)殖場向農(nóng)田土壤的傳播風(fēng)險(xiǎn).

　　土壤是重要的抗性基因儲(chǔ)存庫，其中主要的抗性基因來源包括土壤中固有的抗性微生物所攜帶的抗性基因，以及外源進(jìn)入土壤中抗性微生物所攜帶的抗性基因，但有關(guān)土壤中抗性基因的研究較為缺乏.)指出豬糞施用于農(nóng)田存在抗性基因的水平轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，由于糞源微生物與土壤微生物不同，糞源微生物進(jìn)入土壤后在幾個(gè)月中大量消失，但抗性基因可通過水平轉(zhuǎn)移進(jìn)入土壤本土微生物中，進(jìn)而引起土壤微生物抗性基因豐度的增加.而研究發(fā)現(xiàn)牛糞農(nóng)田利用引起土壤中抗性基因blaCEP豐度的提高是由于攜帶抗性基因的假單胞菌(Pseudomonas sp.)和紫色桿菌(Janthinobacterium sp.)的增殖，而這兩種細(xì)菌來自于土壤，而非糞便引入.糞便農(nóng)田利用可引起抗性基因豐度提高，但其微生物學(xué)機(jī)制仍不明確.

　　畜禽養(yǎng)殖廢水還田利用一定時(shí)間內(nèi)會(huì)顯著提高土壤中抗性基因豐度.對(duì)北京某豬場周邊土壤四環(huán)素抗性基因進(jìn)行了定量檢測，發(fā)現(xiàn)豐度較高的四環(huán)素類抗性基因?yàn)閠etB/P、tetT、tetM、tetO和tetW，其基因拷貝數(shù)范圍在106~108 copies · g-1 DM，并認(rèn)為tet抗性基因存在由畜禽養(yǎng)殖向土壤的轉(zhuǎn)移.的研究發(fā)現(xiàn)，豬場廢水農(nóng)田利用后土壤中抗性基因tetQ、tetZ和整合子intI1、intI2分別提高了500、9和6、123倍.的研究發(fā)現(xiàn)，施用豬場厭氧消化液的土壤中四環(huán)素類抗性基因豐度為105～108 copies · g-1，顯著高于未施用豬場廢水的土壤，而作物類型對(duì)抗性基因的豐度影響較小.)研究了抗性基因沿土壤深度的變化，結(jié)果表明tetO、tetW、tetM、tetA豐度沿土壤深度在0~80 cm逐漸降低.)發(fā)現(xiàn)，飼料中添加磺胺嘧啶顯著影響豬糞還田后土壤中sul抗性基因的變化，添加磺胺處理組在第60 dsul1抗性基因豐度降低至10-3 copies/16S rRNA、而sul2升高至10-1 copies/16S rRNA，飼料未添加磺胺嘧啶處理組sul1和sul2均呈現(xiàn)降低趨勢，豐度分別為10-6和10-5 copies/16S rRNA研究了施用豬糞的玉米根際土壤與非根際土壤微生物群落變化，結(jié)果表明根際土壤sul1和sul2抗性基因略低于非根際土壤，可能與根際環(huán)境磺胺嘧啶降解速度快有關(guān)，而sul基因常與質(zhì)粒結(jié)合，根際土壤是質(zhì)粒發(fā)生結(jié)合轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)區(qū)域.考察了土壤類型對(duì)抗性基因的影響，發(fā)現(xiàn)壤土中sul2基因豐度高于砂土.)采用宏基因組文庫研究了土壤中不可培養(yǎng)細(xì)菌攜帶的抗性基因，結(jié)果表明豬糞還田的土壤攜帶四環(huán)素類、利福平、氨基糖胺類、氯霉素類抗性基因.同未施用畜禽糞便的土壤相比，發(fā)現(xiàn)施用豬糞的土壤中大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因(ermA、ermB、ermF等)和質(zhì)粒(IncQ、IncW)豐度有提高.發(fā)現(xiàn)攜帶多重抗性的質(zhì)粒IncP-1ε在糞便施用后的土壤中擴(kuò)散.

　　在畜禽養(yǎng)殖糞污還田利用時(shí)，不同種類抗性基因隨時(shí)間的消減規(guī)律各不相同.指出施用豬糞后，土壤中抗性基因表現(xiàn)出先增加后降低趨勢，但抗性基因相對(duì)豐度在1年的施肥間隔后無法回到本底值，尤其是sul1、ermB、strB、intI1、IncW repA在土壤中豐度較高.的研究發(fā)現(xiàn)，豬糞還田后sul1、sul2、ermF快速升高，隨后ermF消減速度最快，在施肥43~55 d后降至本底水平，而tetG、tetO、tetW在施肥土壤和控制土壤中無差異;并且作者指出糞便還田后1~2個(gè)月內(nèi)土壤抗性基因豐度較高，應(yīng)采取措施防止抗性基因進(jìn)入水體或鄰近土壤中.不同類型抗生素的抗性基因在土壤中恢復(fù)本底值的時(shí)間不同，例如，MLS抗性基因恢復(fù)到土壤本底值需要20 d，sul1需要2個(gè)月，而四環(huán)素類抗性菌株需要6個(gè)月.關(guān)于畜禽養(yǎng)殖廢水對(duì)養(yǎng)殖場受納水體的影響，發(fā)現(xiàn)豬場氧化塘下游河流中250 m仍可得四環(huán)素抗性基因tetM.研究了福建閩江流域E. coli的耐藥性，畜禽養(yǎng)殖廢水可能是該流域抗生素耐藥率高的重要因素，河水分離的E. coli中41%攜帶一類整合子，整合子介導(dǎo)的抗性基因包括aadA1、drfA1、drfA27、arr3等.

　　有關(guān)土壤環(huán)境中重金屬與抗生素抗性基因的研究較少.指出土壤中Cu含量(0~140 mg · kg-1DM)與tetM、tetW、ermB、ermF具有相關(guān)性，且blaOXA與Cu具有極顯著相關(guān)性;Zn含量(0~38 mg · kg-1DM)與所測抗性基因的相關(guān)性不顯著;因此畜禽養(yǎng)殖糞污在土壤環(huán)境中可能存在重金屬與抗生素抗性基因的協(xié)同選擇問題，需要進(jìn)一步開展研究.

　　畜禽養(yǎng)殖廢水澆灌蔬菜引起蔬菜攜帶抗性基因和耐藥菌的研究非常少，然而該途徑可能是畜禽養(yǎng)殖源抗性基因進(jìn)入食物鏈的途徑之一.對(duì)施用雞糞種植的蔬菜內(nèi)生菌進(jìn)行了耐藥性測試，發(fā)現(xiàn)芹菜、小白菜、黃瓜中頭孢氨芐耐藥菌的比例分別為16.9%~86.33%、21.76%~91.31%和0.21%~0.44%，蔬菜內(nèi)生菌具有抗生素抗性的原因可能是耐藥菌通過土壤進(jìn)入植物，或者由于土壤中抗性基因被植物吸收，這需要進(jìn)一步深入研究.的研究發(fā)現(xiàn)，施用豬糞的蔬菜表皮抗性基因的檢出率較高，包括IncP oriV、sul2、tet(BT)、ermAF、qnrB、blaPSE和blaOXA20等抗性基因，并指出人類直接食用蔬菜是一種接觸土壤耐藥菌和抗性基因的途徑。

　　6 結(jié)語與展望

　　盡管近年來畜禽養(yǎng)殖廢水處理與利用過程抗性基因已開展了一定的研究，但現(xiàn)有研究較多采用現(xiàn)場調(diào)研方式，對(duì)抗性基因的轉(zhuǎn)歸機(jī)制和去除研究不足，缺乏畜禽養(yǎng)殖廢水生物處理與農(nóng)田利用全過程中抗性基因的系統(tǒng)性研究，難以提出抗性基因減控的有效策略.因此，本文提出如下研究展望：

　　1)已有研究大多針對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水生物處理和農(nóng)田利用過程中四環(huán)素類與磺胺類抗性基因的分布規(guī)律，但有關(guān)β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類抗性基因及其耐藥菌的研究較為缺乏，而后者抗生素多用于人類疾病治療，建議今后加強(qiáng)這方面的研究.

　　2)畜禽養(yǎng)殖廢水抗性基因的消減機(jī)制尚不明確.現(xiàn)有畜禽養(yǎng)殖廢水中抗性基因消減規(guī)律的研究不多，對(duì)抗性基因消減規(guī)律的解析不足.已有研究主要考察生物處理對(duì)抗性基因豐度消減的影響，較少關(guān)注功能菌群、工藝操作參數(shù)、環(huán)境參數(shù)與耐藥菌群結(jié)構(gòu)(抗性基因宿主細(xì)菌)的相互關(guān)系.

　　3)不同畜禽養(yǎng)殖廢水和土壤類型、抗性基因類型對(duì)養(yǎng)殖廢水農(nóng)田利用抗性基因的傳播規(guī)律不可一概而論，缺乏系統(tǒng)性的機(jī)制研究.需要從畜禽養(yǎng)殖廢水生物處理和農(nóng)田利用全過程對(duì)耐藥菌、抗性基因轉(zhuǎn)歸和控制措施進(jìn)行系統(tǒng)研究和綜合評(píng)價(jià).